光學(xué)顯微鏡使用可見光進(jìn)行照明,用光學(xué)透鏡進(jìn)行聚焦,人眼或者 CCD/CMOS 相機(jī)進(jìn)行觀察.基本的明場(chǎng)照明顯微鏡由光源、目鏡、物鏡、載物臺(tái)、聚光鏡、光圈等部件組成.收到衍射效應(yīng)的限制光學(xué)顯微鏡的分辨率極限, 其中聚光鏡NA 是數(shù)值孔徑(Numerical Aperture)為物鏡與樣品間介質(zhì)折射率以及孔徑角正弦值的乘積是光學(xué)顯微鏡重要的參數(shù)之一.阿貝極限將光學(xué)顯微鏡的分辨率限制在約200納米處. 為了提高顯微鏡的成像素質(zhì),擴(kuò)展應(yīng)用范圍,光學(xué)顯微鏡經(jīng)過(guò)不斷的發(fā)展改進(jìn),已經(jīng)成為現(xiàn)在產(chǎn)品品質(zhì)保證必要一種光學(xué)設(shè)備.

光學(xué)顯微鏡的成像手段:

普通寬場(chǎng)成像 (Wide field) :光學(xué)顯微鏡基本的成像光路全內(nèi)反射熒光(TIRF):利用光在介質(zhì)界面發(fā)生全反射,在表面形成倏逝波的特性,只對(duì)樣品表面200nm 左右深度內(nèi)進(jìn)行成像,隔絕來(lái)自焦外光線的干擾.

共聚焦(Confocal):利用空間針孔對(duì)焦外光線進(jìn)行隔絕,對(duì)樣品進(jìn)行逐點(diǎn)掃描成像,大大提高z軸分辨率..

多光子(Multi-Photon):利用長(zhǎng)波長(zhǎng)的光波繞射能力強(qiáng),穿透能力高的特性,讓熒光分子同時(shí)吸收多個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)光子激發(fā)短波長(zhǎng)熒光,從而實(shí)現(xiàn)使用較低能量的光照來(lái)對(duì)厚樣品成像.目前成像的深度已經(jīng)達(dá)到毫米級(jí)別.

光片 (Light sheet):對(duì)垂直于物鏡光軸的切片進(jìn)行照明,避免了對(duì)焦外部分樣品的照明,大大提高z軸分辨率,同時(shí)相對(duì) confocal 成像速度更高.

結(jié)構(gòu)光 (Structured light):將照明光進(jìn)行正弦調(diào)制或其它形式的調(diào)制形成結(jié)構(gòu)光照明,與樣品表面形成摩爾紋,使得一部分高頻信息能夠被觀察到.這種方法高能夠提升兩倍的分辨率,屬于一種超分辨技術(shù).

受激發(fā)射損耗 (Stimulated Emission Depletion, STED):熒光顯微鏡中激發(fā)光由于衍射效應(yīng),在樣品上形成的是一個(gè)亮斑,亮斑內(nèi)的熒光分子均被激發(fā)產(chǎn)生熒光,STED在激發(fā)光上嵌套一個(gè)環(huán)形光,使對(duì)應(yīng)環(huán)形區(qū)域的分子發(fā)生受激輻射而不產(chǎn)生熒光,只有中心區(qū)域分子產(chǎn)生熒光,從而突破衍射極限限制的分辨率.STED的分辨率可以達(dá)到30nm左右.

  隨機(jī)光學(xué)重構(gòu) (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM):隨機(jī)激發(fā)單個(gè)熒光分子,對(duì)其光斑進(jìn)行擬合得到中心分子的位置,不斷隨機(jī)激發(fā)分子并將得到的圖案疊加,得到超越衍射極限分辨率的圖像,STORM的分辨率可以達(dá)到20nm左右.